Autor: Pawel Hoszowski (hoszowsk_at_poczta.fm)
Data: Sun 07 Apr 2002 - 01:52:47 MET DST
Katarzyna wrote 2002-03-05:
>Czy ktoś potrafi wytłumaczyć (może być niezbyt szczegółowo) na czym >polegają reakcje ksantoproteinowa i biuretowa? Mam również problemy >ze znalezieniem informacji na temat oznaczania (?) białek >(aminokwasow?) (chodzi o to, by ustalić jakie to białko)-
Trochę późno (ponad miesiąc, heh;), ale dopiero dziś włączyłem listę
i postanowiłem dołożyć do dyskusji o aminokwasach fragment mojej
znowu nigdzie nie wydanej książki (musiałbym wyrzucić parę
rozdziałów, np. XI, a szkoda ;). Znajdują się w niej także odpowiedzi
na tematy poruszane na liście pt.
-redukcja
-uwodornienie związków organicznych
(rozdziały VI, VII, XII).
Jest tam też trochę o mechanizmie pamięci i przyczynach jej pogarszania się, metodach na jej poprawę. Ale tego nie chciałbym dawać całkiem za darmo. Mógłbym wymienić za inne ciekawe dane z czasopism biochemicznych, psychofarmakologii i in. Chętnie nawiązałbym także współpracę z ludźmi pracującymi przy opracowywaniu nowych leków, szczególnie na Alzheimera, Parkinsona, Stwardnienie Rozsiane, CJD. Bardzo ciekawi mnie także chemia snu.
Książka moja nosi tytuł:
AMINOKWASY BUDULCEM I PALIWEM MÓZGU.
REPETYTORIUM Z CHEMII ORGANICZNEJ Z TEMATÓW RÓŻNYCH.
mgr inż. Hoszowski Paweł 1997 - 1999 - 2002
SPIS TREŚCI.
NIEZBĘDNE.
TABELE WYSTĘPOWANIA. OMÓWIENIE NIEKTÓRYCH AMINOKWASÓW.
III. MIARECZKOWANIE AMINOKWASÓW. REAKCJE KATIONÓW DIAZONIOWYCH.
IV. PROSTE ROZDZIELANIE AMINOKWASÓW
tutaj m.in.:
Azotyny i metoda REDOKSYM.
Otrzymywanie oksymów. Reakcje. Przegrupowanie Beckmanna.
Alkilowanie ketonów
Ylidy
Nitrozozwiązki
HYDRAZYNA,FENYLOHYDRAZYNA,DIAZOMETAN,HYDROKSYLOAMINA,CHLOREK AZOTU
Acetonitryl, Reakcja Hoescha
Stare rady Otto Dielsa
Kwasy sulfonowe
Iminy.
Synteza i rozpad (rozszczepianie) amin.
Fenyloaminy.
Dealkilowanie.
Fenylokarbinole. Pochodne benzhydrolu.
Zabezpieczanie ( blokowanie ) grup funkcyjnych. Etery enoli. Acetale.
Benzyloetery.
Fenylowanie
Kation jodoniowy. Jodobenzen. Jodozobenzen. Jodoksybenzen.
Mocznik i tiomocznik
Cyjanoamidy
Ortoestry i iminoetery.
Nitryle , cyjanki , izocyjanki, izocyjaniany, izotiocyjaniany.
Inne izomery RNCO,ROCN,RONC,RCNO , tlenki nitryli.
Aldehyd fenylooctowy.
Kwas fenylooctowy,migdałowy,cynamonowy,propionowy,hydratropowy
styren, alfa-metylostyren,ketopiperydyna,reakcja Prinsa,Blanca
Utlenianie alkenów za pomocą KMnO4
Aldehyd octowy
Dekarbonylacja i dekarboksylacja.
Kwasy: mlekowy, jabłkowy, pirogronowy, mrówkowy, szczawiowy.
==========================================================================
A więc, jako się rzekło...
V. CHARAKTERYSTYKA FIZYKOCHEMICZNA AMINOKWASÓW.
V / 1
Aminokwasy łatwo rozpuszczają się w wodzie, z wyjątkiem "siódemki":
tyrozyna, cystyna, fenyloalanina, tryptofan,lizyna, asparagina, glutamina.
Omówienie.
Najtrudniej rozpuszcza się tyrozyna (0.04g/100) [Mas971]
lub 0.5g [Mizerski254] i cystyna [Karrer].
Do trudniej rozpuszczalnych (do 4% w 20°C i do 9% w 25°C) należą także
aminokwasy z dużą "częścią węglowodorową", a więc fenyloalanina i tryptofan.
Poniższe jednak fakty są już bardziej zastanawiające.
Trudno rozpuszcza się lizyna (6g/100g wody w 25°C), pomimo obecności dwóch
grup aminowych: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOH. Za to jej zcyklizowana
i odaminowana forma, prolina jest NAJLEPIEJ (!) rozpuszczalnym aminokwasem:
1622 g/100g w 25°C wody [Mizerski254] !
Dziwi także fakt, że polarne aminokwasy, jak asparagina i glutamina również
należą do tej grupy. Jeszcze ciekawszym jest, że odpowiednie kwasy:
glutaminowy i asparaginowy choć mają po 2 WOLNE grupy karboksylowe
rozpuszczają się w wodzie w 20°C gorzej (ok.1%) niż odpowiadające im dwa
wyżej podane aminokwasy (ok.3%) zawierające tylko 1-ną grupę karboksylową
przy węglu alfa (druga jest zamidowana).
W 25°C rzecz wygląda podobnie: glutamina 42g, kwas glutaminowy: 8,6g/100.
Asparagina 25g, kwas asparaginowy: 5g/100.
Dalej: cystyna jest odwodornionym dimerem cysteiny i zawiera ugrupowanie
-CH2-S-S-CH2-. Powstaje z cysteiny nawet pod wpływem tlenu w warunkach
alkalicznych. Cystyna rozpuszcza się w wodzie słabo, a cysteina bardzo
dobrze.
Tak więc wymienionych siedem aminokwasów plus dwa odpowiadające im kwasy
rozpuszczają się w wodzie w ilości poniżej 9 % w 25°C.
Cała reszta aminokwasów rozpuszcza się w wodzie dobrze lub bardzo dobrze,
co wynika w prosty sposób z ich silnie polarnego charakteru.
Prolina, seryna, treonina i walina rozpuszczają się w ilościach ponad
88g/100cm3 w 25°C. Prolina (1622g/100) przypomina pod tym względem
sacharozę.
Szczególnie dobrze rozpuszczają się w wodzie lekko zakwaszonej lub
zalkalizo-
wanej, tym lepiej im niższe lub wyższe pH [Kohlmunzer,Masalerz].
W alkoholu są trudno rozpuszczalne z wyjątkiem proliny.
W acetonie są podobnie trudno rozpuszczalne.
Strącanie aminokwasów alkoholem jest częstą metodą wydzielania (szczególnie
w punkcie izoelektrycznym o czym dalej).
Tworzą też trudno rozpuszczalne sole z kwasem pikrynowym i niektórymi
aromatycznymi kwasami sulfonowymi.
Mają wysokie temperatury topnienia, a raczej rozkładu [Mas971].
Mają tzw. punkt izoelektryczny, przy którym najsłabiej się rozpuszczają
(podobnie jak amfoteryczne alkaloidy). Punkt ten dla aminokwasów mających
jedną grupę NH2 i jedną COOH leży w pobliżu pH = 6 +/- 0.1 .
Przykładowo pI dla: glicyny = 5.97, alaniny = 6.02, fenyloalaniny = 5.98,
tryptofanu = 5.88, proliny = 6.10, leucyny = 5.98, waliny = 5.97.
Grupy zakwaszające obniżają pH tego p-ktu: SH - cysteina pI = 5.02,
OH-fenolowa w tyrozynie = 5.65, NH2CO-amidowa w asparaginie = 5.41
i w glutaminie = 5.65, COOH: kwas asparaginowy = 2.87 i glutaminowy = 3.22.
Grupy zasadowe (NH2) podwyższają pI: lizyna = 9.74, arginina = 10.76.
Można je ekstrahować z roślin uwodnionym metanolem a następne adsorbować
na kationitach i eluować roztworami amoniaku [Kohlmunzer.str.79], zupełnie
jak
amfoteryczne alkaloidy na Wofatycie [Elastomery i Plastomery].
V / 2 acylowanie.
W reakcji z chlorkami kwasowymi w obecności NaOH zachodzi N-acylowanie
(reakcja Schottena-Baumanna). Acylować można także bezwodnikiem octowym,
jednak w obecności pirydyny może zajść inna reakcja, Dakina i Westa (1928)
i powstają acyloaminoketony:
R-CH-COOH + CH3-CO-O-CO-CH3 --> R-CH-CO-CH3 + HOOC-O-CO-CH3 NH-CO-CH3 NH-CO-CH3 N-acetylo- acyloaminoketon aminokwas I IIPowstały związek (II) rozkłada się prawdopodobnie na CO2 i CH3COOH, tak więc bezwodnik występuje w roli reduktora redukując kwas do ketonu. Jest to reakcja nie spotykana gdzie indziej w cytowanej literaturze, jedynie otrzymywanie ketonów z soli wapniowych (-CO2 jako CaCO3) jest nieco podobne. Tej ostatniej reakcji towarzyszy zresztą często dekarboksylacja [Marchlewski]
Aminokwasy zawieszone w chlorku acetylu pod działaniem PCl5 przechodzą
w chlorki kwasowe, które znane są tylko w postaci bardzo reaktywnych
chlorowodorków [E.Fisher w Nenit.349].
Pochodne N-acylowe dają w podobnych warunkach chlorki kwasowe. Te ostatnie
reagują normalnie z nukleofilami (acylowanie amin, Friedel-Crafts do
ketonów aromatycznych) ale wydzielają łatwo HCl dając azlaktony [Nenit.349]
[Vogel p.VI.10]. Azlaktony można otrzymać przez acetylowanie aminokwasów
bezwodnikiem octowym a następnie (po ewentualnym podstawieniu reaktywnych
atomów wodoru pomiędzy grupą CO i N) cyklizację bezwodnikiem i octanem sodu.
Otrzymywanie estrów aminokwasów opisano w rozdziale IV (C2H5OH + suchy HCl).
V / 3
Rekcje rozpoznawcze na aminokwasy (autorzy często nie podają że reakcje
cytowane dają tylko niektóre aminokwasy):
- biuretowa (NaOH,CuSO4 po ogrzaniu fioletowe. Czułość niewielka, wystarczy
1-no wiązanie CO-NH jak w biurecie, stąd nazwa).
Powinny ją dawać poliamidy, nie wiadomo czy poliuretany.
- ksantoproteinowa (HNO3 stęż. daje zabarwienie żółte (nitrowanie), po
dodaniu NH3 lub NaOH - pomarańczowe na skutek tw. się nitrofenolanów).
Jest to reakcja na fenyloalaninę, tyrozynę i tryptofan.
- Reakcja Millona (Hg(NO3)2 + HNO3 -> czerwonobrunatny osad, koagulat)
Pożądane jest, aby roztwór zawierał nieco kwasu azotawego - patrz
przygotowanie odczynnika. Jest to reakcja na tyrozynę.
- Reakcja Pauly'ego. (Pauliego) Kwas p-diazobenzenosulfonowy dodany do r-ru
białka zalkalizowanego Na2CO3 daje zabarwienie czerwone. Po zakwaszeniu
barwa zmienia się na żółtoczerwoną.
Jest to reakcja na tyrozynę i histydynę (sprzęganie).
- Zasadowe roztwory fosforomolibdenowych r-rów niebieszczeją (redukcja)
Jest to reakcja na tyrozynę.
- Reakcja Adamkiewicza, Hopkinsa i Cole'a. Po dodaniu kwasu glioksalowego
(wystarczą ślady, Nenitescu str.413) i H2SO4stęż do r-ru białka występuje
błękitnofioletowe zabarwienie.
Jest to reakcja na tryptofan.
- Reakcja Ehrlicha z r-rem chlorowodorku p-dimetyloaminobenzaldehydu.
(4-dimetyloamino-benzaldehyd). Powstaje fioletowe zabarwienie.
Jest to reakcja na tryptofan i indol.
- Reakcja Sakaguchi - reszty argininy dają intensywnie czerwone zabarwienie
powstające pod wpływem NaOCl i ŕ-naftolu
- Próba Molischa. W obecności H2SO4 i alfa-naftolu roztwory białkowe dają
fioletowy pierścień na granicy płynów. Próba świadczy o obecności glikoproteid
ów.
- Siarka z cysteiny i cystyny daje czarny PbS z octanem ołowiu w r-rze
alkal.
- Metoda hydantoinowa. Hydantoiny powstają z aminokwasów przez działanie
KNCO,
HNCO lub reakcję z mocznikiem (z którego p.wpł.ogrzewania powstaje HNCO +
NH3).
Np. z fenyloalaniny powstanie benzylohydantoina. Produktem pośrednim są
kwasy hydantoinowe: HOOC-R-NH-CO-NH2, które cyklizując pod wpływem
dalszego
ogrzewania przechodzą w pięcioczłonowe hydantoiny.
Wg "Jakościowa Analiza Organiczna" [Woliński]: 0.4g substancji
+ 0.2g mocznika + 15cm3 wody barytowej ogrzewać do wrzenia 30-60 min.,
potem CO2 do strącenia całego Ba2+. Klarowny przesącz bez Ba2+ odparować
do sucha, +H2O, wytrącić CH3COOH. Szukać temperatury topnienia w tabeli.
- Reakcja ninhydrynowa. Aminokwasy, polipeptydy i peptony gotowane z wodnym
roztworem hydratu trójketohydroindenu (ninhydryna) dają błękitne
zabarwienie
(od różowego do fioletowego) z wyjątkiem proliny i hydroksyproliny które
dają zabarwienie żółte. Zabarwienie z ninhydryną pojawia się po ogrzaniu
do
80-100°C. Stosuje się w chromatografii [Kohlmunzer1977s79].
Reakcja ta może służyć także do ilościowego oznaczania aminokwasów.
Podczas tej reakcji następuje dekarboksylacja i utlenienie aminokwasu do
aldehydu i CO2 a wydzielony amoniak łączy się z cząsteczką ninhydryny oraz
cząsteczką związku powstałego przez redukcję pod wpływem aminokwasu
tworząc
tzw. purpurę Ruhemanna, intensywnie czerwono fioletowy związek.
Jak z tego wynika, obecność amoniaku nie może zawyżać wyników dlatego, że
czysty amoniak nie powoduje redukcji ninhydryny i nie ma składnika II.
Możliwe jest to jednak w przypadku obecności substancji redukujących.
[Woliński] pisze nawet, że liczne substancje z I-rz grupą aminową a także
amoniak (!) oraz aldehyd propionowy [?] dają reeakcję z ninhydryną.
W obecności CH2O (reduktor) NH3 winien więc się oznaczać dobrze.
(wzory widoczne po włączeniu czcionki proporcjonalnej, np. COURIER
i wyłączeniu zawijania tekstu)
CO CO CO CO
/ \ / \ / \ / \
Ph CO + Ph CH-OH + NH3 ----> Ph C=N-CH Ph
\ / \ / \ / \ /
CO I CO II III CO CO IV
ninhydryna alkohol powstały po utlenianiu purpura Ruhemanna
aminokwasu do aldehydu i amo- (Ruhemann 1910)
niaku
To archiwum zostało wygenerowane przez hypermail 2.1.7 : Thu 08 May 2003 - 14:51:06 MET DST